腫瘤免疫治療，實際上分為兩大類：

一種把腫瘤的特征“告訴”免疫細胞，讓它們去定位，并造成殺傷，例如CAR-T、TCR-T、TIL、MASCT（DC-CTL）等；

另一種是解除腫瘤對免疫的耐受/屏蔽作用，讓免疫細胞重新認識腫瘤細胞，對腫瘤產(chǎn)生攻擊，例如PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體等。臨床上將不同的免疫療法聯(lián)合應用效果有可能會更好。

目前有三種使用效應T細胞的過繼細胞療法(Adoptive cellular therap,ACT)正朝著注冊審批的方向行進（圖1）。

圖1：目前細胞治療的幾種途徑

腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）雖發(fā)展緩慢，但數(shù)十年來一直進步，近期一項針對轉移性黑色素瘤的國際III期隨機試驗已經(jīng)完成（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00200577），這項研究前后經(jīng)歷十多年，最終結果還是不錯的，不管在復發(fā)還是長期生存方面，TILs都是有效的。

那么，什么是CAR-T和TCR-T呢？

CAR-T（Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell）和基因修改的T細胞受體（Gene Modified TCR）。這兩種技術的一個共同點在于通過基因改造的手段提高T細胞受體對特異性癌癥細胞抗原的識別能力和進攻能力。因此也都統(tǒng)稱為“T細胞受體重新定向”技術（Tcell receptor redirection）。但兩者所使用的方法是不同的。

嵌合抗原受體T細胞技術（CAR-T）以及T細胞受體（TCR）嵌合型T細胞（TCR-T）作為當前過繼性細胞回輸治療ACT技術兩大最新的免疫細胞技術，因其能夠表達特異性受體靶向識別特異性的細胞如腫瘤細胞，受到廣泛的關注和研究，從最開始的基礎免疫研究轉變?yōu)榕R床應用。基于合成生物學，免疫學，遺傳改造技術，使得合成改造的特異性功能加強版的T細胞成為可能。CD19抗原特異性CAR-T 細胞用于治療B細胞白血病和淋巴瘤臨床試驗中，顯示出持續(xù)的疾病緩解效果。由于CAR-T/TCR-T技術的優(yōu)越表現(xiàn)，以及廣闊的應用前景，從而使其進入了當前激烈的制藥行業(yè)競技舞臺中與傳統(tǒng)的制藥業(yè)一較高低。

通過修飾，使正常供體細胞的同種異體排異反應失活，同時使用抗腫瘤的CAR或TCR武裝它；或利用抗腫瘤分子武裝患者自體細胞。在實體腫瘤中，活檢標本可用來分離TILs并進行擴增。大多數(shù)情況下，病人在接受抗腫瘤淋巴細胞輸注前需要接受必要的預處理，并須謹慎處置治療引發(fā)的毒性。

T細胞和T細胞受體

T細胞是我們肌體細胞免疫機制中非常重要的一類細胞。這類細胞之所以被稱為T細胞是因為它們成熟和分化的過程是在胸腺（Thymus）里完成的。

T細胞有一點像我們身體的“紀委巡視組”。它們在肌體內巡邏時，不斷地和各種細胞進行“親密”接觸，以檢查細胞內部是否正常。而這種接觸和檢查工作主要是通過一種稱之為“T細胞受體”來進行的。細胞方面和“T細胞受體”交接的是一類被稱為“MHC”（或者在人類被稱為HLA）的表面蛋白。這類蛋白的功能就是把細胞內部蛋白分解后的片段呈現(xiàn)給T細胞。供T細胞檢查。如果T-細胞發(fā)現(xiàn)其中有變異的蛋白片段，就可能對細胞發(fā)起進攻，摧毀變異的細胞。這也就是我們免疫系統(tǒng)如何能夠長期保持我們無癌生活的主要原因。

但癌癥還是會經(jīng)常發(fā)生。這里的原因固然很多，也很復雜。但總體來講，癌癥發(fā)生說明我們的T細胞已經(jīng)失去了識別癌細胞以及摧毀癌細胞的能力。而提高T細胞識別能力的關鍵就在于改進“T細胞受體”。從這個角度去思考，就產(chǎn)生了我們剛剛提到的這兩種細胞免疫治療技術：CAR-T和基因修改的T細胞受體。

CAR-T與TCR-T的區(qū)別

我們可以打一個簡單的比喻。CAR-T是一種“換頭”技術。它把TCR的“頭”直接換成一個特異性的抗體。這樣就可以讓T細胞就在抗體的指引下直接攻擊癌細胞。和CAR-T這種大手筆的改動相比，基因修改的T細胞受體可以說只是簡單地“理了理發(fā)”。

用來“理發(fā)”的T-細胞并非任何T細胞。這類T細胞通常會“侵入”癌組織。這說明他們對癌細胞有一定的識別能力。事實上，我們可以在這類T細胞中發(fā)現(xiàn)對癌細胞相關抗原（Tumor Associated Antigen, TAA）具有特異性識別能力的T細胞。這類抗原包括CEA，Her-2，CD19，gp100, MART-1, MAGA-A3, NY-ESO-1, 等等。這些TAA在不同的癌癥中都有相對特殊性的表達。因而也成為免疫系統(tǒng)的攻擊對象。盡管如此，這些天然（或者通過其他手段制造的）的“抗癌”T細胞的識別能力常常比較弱，因此不能形成對癌細胞的有利攻擊。在這種情況下，可以通過部分基因修改的方法來提高這些TCR對相應TAA的“親和力”和戰(zhàn)斗力?！盎蛐薷牡腡CR”技術也因此被稱為“親和力增強的TCR”技術（Affinity-Enhanced TCR）。

這次《自然-醫(yī)學》雜志報道的就是由美國馬里蘭大學醫(yī)學院，濱州大學醫(yī)學院和目前免疫治療的“當紅炸子雞”之一：Adaptimmune公司聯(lián)合研發(fā)的一款“基因修改的TCR”。在修改了幾個關鍵氨基酸以后，這些基因修改的TCR大大提高了和一種常見的癌癥TAA，NY-ESO-1，的親和力。從而可以用來進攻有NY-ESO-1過量表達的癌癥，比如多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma）。 在這次臨床試驗中，80%的多發(fā)性骨髓瘤患者有了很好的臨床應答。其中70%的患者達到完全或接近完全應答。平均無進展生存期達到了19個月。這樣的結果可以說是非常驚人振奮的。

目前這兩種方法，發(fā)展都比較迅速，但是都不完美。

開發(fā)最佳的CAR設計

過去的20年中CAR的設計已經(jīng)取得了長足的進展（圖2）。1991年有3個實驗室報道了第一代CAR的設計。Kuwana等人最先構造了嵌合受體，使T細胞不依賴于MHC-I類分子識別靶細胞。Roberts、Finney和 Lawson 率先構造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的二代CAR。在臨床前模型中，使用基于CD28的體外擴增體系，在異種移植瘤模型中 4-1BB比CD28對CAR的功效更有益。兩種CAR模型都顯示出臨床前和臨床療效。Long等人的最近研究表明，基于CD28構造的CAR加強并加速T細胞衰竭，而基于4-1BB構造的CAR減緩了T細胞衰竭。我們的研究結果與其結論一致，并且發(fā)現(xiàn)CD28內切域能傳遞使效應T細胞終末分化的信號。從這些研究中得出的周密的結論并不是說某個人源內切域必然比另一個好，而是說CD28信號是生產(chǎn)有效的臨床T細胞制品的關鍵，而4-1BB提升了CAR-T細胞的持久性。

圖2：CAR-T細胞的設計

第一代CAR引入了CD3ζ鏈或類似的信號域。基于抗體再定向的T細胞首先由Kuwana設計并由Eshhar完善。Roberts和Finney首先設計了整合CD28或CD137信號域的第二代CARs

為了進一步改良CAR的設計，許多研究組開始著眼于發(fā)展第三代CAR，不僅包括“信號1”、“信號2”，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同材料開展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結果是矛盾的。不過，新一代CAR-T能有效控制毒性。

透視ACT毒性

十多年來，許多ACT臨床試驗表明各類工程化的細胞產(chǎn)品相當安全，但有效性相對缺乏。過去的4年里，ACT的療效發(fā)生了一場革命性變化，體現(xiàn)在工程化的T細胞可以在體內大量擴增，甚至在某些情況下可以持續(xù)性存活。這徹底的改變了ACT的療效，尤其體現(xiàn)在CAR-T細胞應用于癌癥治療，但是在顯示出療效的同時，伴隨有毒性。

細胞因子釋放綜合征（CRS）

CAR-T治療骨髓源腫瘤最顯著的毒性是CRS。高度增殖的T細胞能引起CRS，表現(xiàn)為高熱和肌痛，不穩(wěn)定的低血壓和呼吸衰竭。這是一個意想不到的結果，因為在臨床前動物模型中沒有出現(xiàn)類似癥狀。

從CRS觀察中發(fā)現(xiàn)一個關鍵的點，除了預期的效應細胞因子INF-γ外，IL-6在CAR-T治療的細胞指數(shù)級增殖期間也會迅速提升。CRS可能直接與另一個毒性相關聯(lián)，即巨噬細胞活化綜合征。

幸運的是，針對這些嚴重的CRS，尋找到了一種治療方法，應用IL-6受體拮抗劑tocilizumab來阻斷IL-6的作用。采用高度增殖的CAR-T治療ALL患者，確認了IL-6的出現(xiàn)和tocilizumab對嚴重CRS的療效，并且我們觀察到了雙特異性T細胞銜接抗體blinatumomab引起的嚴重CRS具有類似機制。

另一個重要發(fā)現(xiàn)是，嚴重的CRS幾乎發(fā)生在高疾病負荷病人身上。這意味著將CAR應用于疾病早期患者身上，在疾病惡化之前使用CAR-T來殺滅腫瘤，發(fā)生嚴重CRS風險將大大降低。

關于靶向毒性

T細胞增殖可直接導致CRS。它不依賴于改造的T細胞的抗原特異性，即使CAR是相同的，治療不同的疾病有可能CRS風險和癥狀也會有所不同。例如在治療CLL和彌漫大B時CRS較輕而治療ALL時CRS相對較重。

除了CRS，還存在由工程改造的T細胞的抗原特異性導致的“靶向”毒性。例如溶瘤綜合征，它直接是由腫瘤細胞的裂解而導致的。當CARs靶向于B細胞表面表達的靶點如CD19時，會引起B(yǎng)細胞發(fā)育不良，這就是一個“靶向”毒性，但卻錯誤的攻擊了正常組織細胞的結果。只要CD19 CAR-T細胞長時間存在，B細胞發(fā)育不良的情況就不會改善，因此，B細胞缺乏可作為CAR-T療效持續(xù)的標志。B細胞發(fā)育不良與CD20特異性單抗治療一樣會造成嚴重的低丙種球蛋白血癥，需要靜脈注射免疫球蛋白。不像CD20 單抗 rituximab引起的相對較輕的低丙種球蛋白血癥，CAR引起的長期B細胞發(fā)育不良，靜脈注射免疫球蛋白非常必要。

最近報告了輸注改造的T細胞引發(fā)致命毒性的2個案例，有一例患者接受了HER2-CAR治療，兩例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T細胞治療。在這2個案例中，均是因為正常組織表達這些靶點，導致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T細胞無法區(qū)別表達靶向抗原的正常細胞和腫瘤細胞所致。高親和力TCR改造的T細胞引起的毒性可能與親和力成熟過程有關，因為“非腫瘤靶向”的高親和力TCR的產(chǎn)生在生理條件下將受到限制。在設計TCR的過程中，小心篩選高親和力的TCRs，并研究其對靶蛋白之外的其他抗原表位的識別顯得十分必要。根據(jù)已有報道，輸注HLA-A2/MAGE-A3特異性的TCR-T細胞能夠產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

神經(jīng)毒性

CAR-T治療白血病會引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這是一個預期之外且目前尚不清楚的現(xiàn)象。幾個研究小組報道，這些癥狀具有多樣性但可自行消退，如譫妄、語言障礙、運動障礙、緘默癥和癲癇發(fā)作。雖然與全身CRS的發(fā)生有些時間上的關聯(lián)，當然也與CAR-T存在于腦脊液中相關，但是使用tocilizumab這些癥狀不會有改變。這些癥狀的機制與靶組織仍有待確認。

其他毒性

輸注活化的T細胞存在引起自身免疫性疾病的風險。靶向黑色素瘤的ACT治療可誘發(fā)白癜風。輸注活化的T細胞產(chǎn)生如皮疹、結腸炎、垂體炎等毒性的報道較少。CAR修飾的T細胞尚未出現(xiàn)這些問題。輸注同種異體T細胞存在抗宿主移植病的潛在風險。這可能會引起曾接受同種異體造血干細胞移植的患者的擔心。幸運的是，從受體采集已耐受供體來源的T細胞（而不是捐獻者），抗移植物宿主病的風險會非常低。當然有一種方法是利用自殺系統(tǒng)來限制毒性，如經(jīng)典的caspase-9 誘導表達系統(tǒng)，或包含特定表面靶點如CD20。在含有caspase-9誘導系統(tǒng)下，一種水溶性活化劑可激活Caspase系統(tǒng)導致T細胞凋亡。包含CD20基因修飾的CAR-T細胞，可用單抗如rituximab來清除“違規(guī)”的細胞。

該領域面臨的問題

近期實驗室研究正在解決在科學與工程方面遇到許多挑戰(zhàn)。下面我們談一談當前面臨的挑戰(zhàn)。

細胞制品的構成:

早期的細胞治療主要是輸注高分化的CD8+T細胞。這些CTL細胞具有很強的細胞毒性，但是輸注后沒有足夠的復制能力，除了個別情況外，注入患者體內的T細胞持久性較差。目前普遍同時輸注CD4+與CD8+T細胞，很可能是因為CD4+T細胞提供生長因子和其他信號以維持輸注的CTL的功能和活性。

另外，在小鼠中的研究有時候會誤導處理人源T細胞的方法。例如，由于受到端粒退化的影響，人源T細胞的復制能力有限，在小鼠模型中卻沒有這個特點，而人CD4+細胞比小鼠CD4+細胞具有更強的細胞毒性。現(xiàn)在的問題是是否需要利用流式細胞術或其他的方法分離細胞亞群并進行獨立培養(yǎng)。CD4+和CD8+T細胞最佳細胞培養(yǎng)條件不同，這因為CD4 +和CD8 + T細胞信號轉導途徑不一樣。此外，細胞分離法可去除對效應T細胞療法存在潛在危害的Treg細胞。況且，需要從輸注的T細胞中去除腫瘤細胞，對白血病患者而言，這尤其具有挑戰(zhàn)性。然而，在GMP生產(chǎn)中有些技術使細胞制備成本大大增加，如通過流式細胞術或磁珠分選細胞可使成本迅速增加10000美元甚至更多。

年齡問題:

與上述問題相關，輸注處于什么分化階段的T細胞最佳？對小鼠和人類的研究結果表明，naive或中心記憶細胞是最好的。對只有少量naive T細胞的老年人而言，如何獲取這類細胞是個挑戰(zhàn)，且化療或其他疾病通常會進一步放大難度。

從采用CD19 特異性CAR-T治療白血病患者的數(shù)據(jù)中表明，擴增能力是預測成功的最重要的生物學標志。一種方法是在全血淋巴細胞中分離中心記憶或naive T細胞。與此相反，一個更簡便粗放的方法是使用大量T細胞在特定培養(yǎng)條件下維持naive或中心型記憶細胞的擴增。

后一種方法基于特異性共刺激信號可以促使細胞定向分化的原理。如CD28的刺激可使CD4細胞保持中心記憶細胞狀態(tài)，4-1BB可以促使CD8中心記憶細胞的增殖。相反ICOS共刺激分子可以促使和穩(wěn)定Th17細胞的生長。利用T細胞的干細胞樣特性是非常有希望的，Wnt信號通路的激活可以促進記憶干細胞的增殖。

是否存在統(tǒng)一的最佳細胞制品配方？抑或針對不同的腫瘤需要不同的配方？

CD19 CAR-T治療B細胞惡性腫瘤顯示出的驚人且意想不到的療效能否出現(xiàn)在治療實體瘤患者身上還未可知。我們發(fā)現(xiàn)CAR-T在體外殺滅低分化腺癌細胞的效率類似于白血病。然而，仍然有待進一步確定是否需要修改細胞組成類型或細胞培養(yǎng)條件，用來優(yōu)化實體瘤患者體內改造的T細胞的轉運和持久性。

與惡性血液疾病的散在分布不同，采用細胞工程的方法優(yōu)化T細胞向實體瘤塊轉運，如成膠質細胞瘤和胰腺癌，可能會有所不同。已提出一種方法是利用靶向策略，如采用基因工程的手段，使用各種趨化因子或趨化因子受體促使T細胞向腫瘤部位富集。其他方法包括對腫瘤或患者進行預處理，如進行放療，注射溶瘤載體以及在瘤內直接注射T細胞。

最優(yōu)的共激活結構域在CD4+和CD8+ T細胞內是一樣的嗎？

以往研究表明不同亞群的T細胞培養(yǎng)條件是不同的。這就提出一個問題，不同淋巴細胞亞群的T細胞是否需要不同的信號分子進行武裝呢？為著手解決這個問題對CD4+和CD8+T細胞胞內區(qū)CD28, 4-1BB和ICOS進行了評估。在異種移植腺癌的人源化小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)采用ICOS信號域的CD4+ CAR-T細胞更為優(yōu)越，而CD8+T細胞常優(yōu)選4-1BB。如此增加細胞制備的復雜度是否能使臨床實驗受益尚有待進一步確定。此外，最佳的T細胞亞群比例和信號分子的構造在不同的腫瘤微環(huán)境中很可能會有差異。比如在一些臨床前腫瘤模型中改造的Th17細胞比Th1細胞更優(yōu)越。

生存與毀滅：自殺結構能否減弱非腫瘤靶向引起的毒性?

使用改造的T細胞最大的不確定性是利用生物合成技術誘導的新的、增強的細胞效應是否會引發(fā)意外的脫靶毒性。

CAR-T細胞的非腫瘤靶向毒性和TCR細胞的脫靶毒性被格外關注。有多種方法可以緩解這些問題。我們發(fā)現(xiàn)利用編碼CAR的mRNA轉染T細胞，限制CAR僅在轉染T細胞中表達，對評估出現(xiàn)的直接毒性有幫助。當出現(xiàn)毒性反應，停止細胞輸注，毒性會迅速減弱。研究人員也提出了許多誘導基因修飾T細胞凋亡的方法。這些方法很可能都會被整合，以便按需清除T細胞，滿足嚴格的安全需求。

結 論

基于正在進行的試驗，表達CARS和TCRS的T細胞已經(jīng)為廣泛的商業(yè)應用準備就緒。華爾街的資源正推動這個曾因投資不足而被限制的領域的進步。在輸注的T細胞中引入或刪除基因，提供了能克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的新細胞制品，并且最后可能不需要使用免疫檢查點封閉抗體。ACT先進的基因工程技術的到來，將會使利用合成生物學原理進行癌癥、慢性感染和自身免疫性疾病的治療取得顯著進展。